2024年3月，來自江南大學食品科學與技術國家重點實驗室的夏書芹研究團隊，在期刊《Food Bioscience》（IF=5.9）上發(fā)表了一項研究。該研究探討了甘油對山梨醇-甘氨酸體系在熱處理過程中褐變反應的影響機制，具體研究了甘油濃度與加熱時間對該體系褐變程度、無色中間產物積累、熒光物質生成及α-二羰基化合物動態(tài)變化的影響，并從水活度和水分狀態(tài)角度解釋了甘油依賴型褐變的原因。

摘要

在山梨醇和氨基酸體系的高溫加工和長期儲存過程中，觀察到了意想不到的褐變現象。本研究探討了甘油對不同熱處理時間下山梨醇-甘氨酸模型體系褐變反應的影響。結果證實，部分山梨醇會轉化為葡萄糖和果糖，這些還原糖與甘氨酸發(fā)生美拉德反應，生成類黑精。甘油濃度和加熱時間與反應進程呈正相關，這反映在褐變指數增加、無色中間產物增加以及熒光物質積累上。與不含甘油的體系相比，當甘油濃度為4 mol/L時，褐變指數增加了約100倍，無色中間產物的積累增加了65倍。此外，體系中α-二羰基化合物（乙二醛、甲基乙二醛和2,3-丁二酮）的含量受到甘油的影響，隨著類黑精的積累呈現先增加后減少的趨勢，在加熱2 h后達到190.6 mg/L的峰值。甘油依賴型褐變與體系始終處于較高水平的水活度（>0.80）以及游離水向固定水的遷移率（0.60%至8.59%）有關。這表明，甘油可通過影響底物濃度、削弱產物的抑制作用以及促進山梨醇向還原糖的轉化來推動褐變反應。

實驗材料與儀器

實驗材料

山梨醇、乙二醛和2,3-丁二酮、甲基乙二醛、甘油、甘氨酸、葡萄糖和果糖、鄰苯二胺

實驗儀器

紫外-可見分光光度計、熒光光譜儀、高壓離子色譜儀、超高效液相色譜儀、GBX eFAst-Lab水分活度儀、脈沖核磁共振分析儀、壓力反應瓶、油浴鍋

實驗過程

1、反應溶液的配制：用去離子水配制含有0.25 mol/L甘氨酸、1.25 mol/L山梨醇和不同濃度甘油（0-4.00 mol/L）的反應溶液，使用HCl溶液（2.00 mol/L）和NaOH溶液（2.00 mol/L）將pH調節(jié)至6.80。將溶液轉移至壓力反應瓶中，在120°C的油浴中分別加熱0、1、2、3和4 h。加熱結束后，將樣品取出并置于冰水中以終止反應。

2、褐變指數與無色中間產物的測定：取反應溶液，使用紫外-可見分光光度計在420 nm波長下測定褐變指數，在294 nm波長下測定無色中間產物含量。由于吸光度超出有效范圍，將溶液濃度稀釋至原濃度的1/10后在294 nm下進行測定。

3、熒光強度測定：使用熒光光譜儀對反應溶液中的熒光物質強度進行測定，激發(fā)波長設為347 nm，發(fā)射波長范圍設為400-600 nm。

4、還原糖含量的測定：采用高壓離子色譜儀（HPIC）測定還原糖（葡萄糖、果糖）含量。使用PA20色譜柱進行梯度洗脫，流動相A為0.1 mol/L乙酸鈉溶液，流動相B為250 mmol/L NaOH溶液。色譜條件為：0-13 min保持2% NaOH，13-14 min線性梯度從2% NaOH升至80% NaOH，14-23 min保持80% NaOH。流速10.5 mL/min，進樣量10 μL。

5、α-二羰基化合物的測定：采用鄰苯二胺（OPD）對α-二羰基化合物（乙二醛GO、甲基乙二醛MGO和2,3-丁二酮）進行衍生化處理，使其轉化為喹喔啉結構。使用超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用系統(tǒng)（UPLC-TQD）進行定量檢測。色譜條件：Agilent LiChrospher C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm, 5 μm），柱溫40°C，進樣量1 μL，紫外檢測波長320 nm，流速1 mL/min。流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序為：0-1 min保持0%乙腈，1-10 min線性梯度升至30%乙腈，10-12 min線性梯度升至50%乙腈，12-12.5 min線性梯度升至100%乙腈，12.5-15 min線性梯度降至0%乙腈。質譜采用電噴霧正離子模式（ESI+）檢測。標準曲線如下：GO：y = 95.98x + 194.5（R2 = 0.9991），MGO：y = 745.18x – 2071.7（R2 = 0.9995），2,3-BD：y = 1952.4x – 4303.7（R2 = 0.9997）。

6、水活度的測定：使用GBX eFAst-Lab水分活度儀測定樣品水活度。測試前，選擇水活度為0.84的標準樣品對水活度測定儀進行校準。校準完成后，將4 mL樣品溶液置于樣品盤中，在25°C下進行測定。

GBX eFAst-Lab水分活度儀

7、水分狀態(tài)分析：使用脈沖核磁共振分析儀（LF-NMR）對水分狀態(tài)進行分析。將裝有5 mL樣品的樣品瓶放入直徑25 mm的核磁管中，通過CPMG RF脈沖序列采集信號。參數設置為：90°脈沖時間7 μs，180°脈沖時間14 μs，重復時間9000 ms，回波次數16000次，回波時間1.3 ms。最后使用核磁共振反演軟件（版本2.0）獲得橫向弛豫時間（T2）曲線。

實驗結論

1. 甘油促進褐變反應：隨著甘油濃度和加熱時間的增加，體系褐變指數和無色中間產物含量均呈上升趨勢。當甘油濃度為4 mol/L時，與不含甘油的體系相比，褐變指數增加約100倍，無色中間產物積累增加65倍。這表明甘油能夠推動山梨醇-甘氨酸體系的褐變反應進程。

2. 甘油影響α-二羰基化合物動態(tài)變化：α-二羰基化合物（乙二醛、甲基乙二醛和2,3-丁二酮）在體系中的含量呈現先增加后減少的趨勢，在加熱2 h后達到190.6 mg/L的峰值。這表明隨著反應進入類黑精積累階段，α-二羰基化合物的消耗速率大于生成速率。

含不同濃度甘油的山梨醇-甘油醛體系在不同時間熱處理后水活度的變化

3. 甘油通過水分狀態(tài)調控反應：體系水活度始終保持在較高水平（>0.80）。隨著甘油濃度升高，游離水比例降低（從加熱4 h后的99.43%降至91.41%），固定水比例增加。游離水減少有利于山梨醇的脫水分解，促進還原糖的生成，從而推動美拉德反應。

4. 反應機制：部分山梨醇轉化為葡萄糖和果糖，暴露出羰基，與甘氨酸發(fā)生美拉德反應生成類黑精。甘油通過影響底物濃度、削弱產物抑制作用以及促進山梨醇向還原糖的轉化來增強褐變反應。

參考文獻

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2.Smarrito-Menozzi, C., Matthey-Doret, W., Devaud-Gounoens, S., & Viton, F. (2013). Glycerol, an underestimated flavor precursor in the Maillard reaction. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61(43), 10225-10230. 

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